دستگاه الایزا
ELISA مخفف عبارت Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay يك روش آزمايشگاهي بيوشيميايي ساده با حساسيت
بسيار بالا است كه امكان آناليز تعداد زيادي نمونه را به صورت همزمان فراهم مي
كند. اين روش در ايمونولوژي (ايمني شناسي) براي تشخيص وجود يك آنتي بادي يا
آنتي ژن در نمونه مورد آزمايش استفاده مي شود كه عموما به عنوان ابزاري تشخيصي در
پزشكي و پاتولوژي و همچنين تست كنترل كيفيت در بسياري از صنايع كاربرد دارد.
ELISA بر پايه اندازه گيري كمپلكس رنگي آنتيژن و آنتيبادي استوار است. به اين ترتيب كه نمونه مورد آزمايش با مقدار نامشخصي آنتي ژن روي فاز جامد (معمولا پليت پلي استيرن) ريخته مي شود، سپس آنتي بادي بازيابي اضافه ميشود تا با آنتي ژن واكنش داده و تركيبي ايجاد كند. آنتي بادي بازيابي با آنزيم پيوندي كووالانسي برقرار مي كند. بين هر مرحله پليت با محلول پاك كننده ملايمي شسته مي شود تا هر پروتئين يا آنتي بادي باقيمانده شسته شود. پيش از آخرين مرحله شستشو، پليت با اضافه كردن زير لايه آنزيمي كشت داده مي شود و ماده رنگي توليد ميشود. طول موج رنگ به دست آمده توسط يك دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت شده و ثبت ميشود كه اين طول موج معرف حضور يك آنتيبادي يا آنتيژن و نيز غلظت آن است. در ELISA هاي قديمي تر زيرلايه رنگزا به كار گرفته ميشد در حاليكه در تست هاي جديدتر زيرلايه هاي فلوروژنيك با حساسيت بسيار بالاتر مورد استفاده قرار مي گيرد.
امروزه ELISA يكي از
قدرتمند ترين روش هاي آزمايشگاهي براي پي بردن به اختلالات سيستم ايمني است، اين
تست به منظور پي بردن به آنتيژن ناشي از ارگاني عفوني در بدن يا مواد غير نرمالي
كه معرف برخي بيماريها است انجام مي شود. همچنين
آنتي باديهايي كه در پاسخ به برخي عفونتها يا بيماريها بهوجود آمده نيز توسط
اين تست قابل تشخيص هستند. تست ELISA اولين آزمايش متداول در غربالزني HIV است. در
تست ELISA سرم فرد 400 بار رقيق شده و به صفحه اي كه حاوي
آنتيژن HIV است اضافه ميشود. اگر آنتي بادي HIV در سرم
وجود داشته باشد، به اين آنتيژن هاي HIV مي چسبد.
سپس به منظور از بين بردن ديگر اجزا سرم، پليت شستشو داده مي شود. يك "آنتي
بادي ثانويه" ساخته شده مخصوص (يك آنتي بادي چسبيده به آنتي بادي ديگري) به
پليت اعمال شده و شستشوي ديگري انجام ميشود. اين آنتي بادي ثانويه به صورت
شيميايي به آنزيم از پيش تهيه شده ميچسبد. اينبار زير لايه اي براي آنزيم اعمال
شده و توسط آنزيم كاتاليز ميشود كه منجر به تغيير رنگ در فلورسانس مي شود.
نتايج ELISA به صورت
عددي گزارش ميشود. بحثانگيزترين وجه اين تست تعيين نقطه برش بين نتايج مثبت و
منفي است.
علاوه بر آزمايش HIV از ELISA براي آزمايش بيماريهايي چون هپاتيت، تب استخوانشكن، leptospirosis ، عفونت انگلي، تبخال، سرخجه و ديگر عفونتهاي ويروسي و باكتريايي استفاده ميشود.
پيش از پيدايش روش ELISA ، تنها گزينه براي انجام سنجش ايمني، ايمني سنجي راديويي بود، كه از آنتي ژن ها و آنتي بادي هايي كه به صورت راديواكتيو مميز شده بودند استفاده ميشد. در اين روش در صورت وجود آنتي بادي يا آنتيژني خاص، راديواكتيويته سيگنالي توليد ميكرد. تئوري روش ايمني سنجي راديويي اولين بار سال 1960 توسط Rosalyn Sussman Yalow و Solomon Berson مطرح شد. از آنجاييكه راديواكتيويته خطرات زيستي داشت، پيشنهاد امن تر و ايمن تري مبني بر جايگزيني سيگنال هاي غير راديو اكتيو به جاي سيگنال هاي راديو اكتيو ارائه شد. وقتي يك آنزيم مشخص (مانند پر اكسيداز) با زير لايه مناسب واكنش مي دهد، منجر به تغيير رنگ آن ميشود كه مي تواند به عنوان سيگنال استفاده شود. البته بايد تناسب بين سيگنال و وجود آنتيبادي يا آنتي ژن تعيين ميشد كه اين پروسه توسط Stratis Avrameas و G.B. Pierce انجام شد. در سال 1966 توسط Wide و Porath اين روش تكميل تر شد.
و در سال 1971 Peter Perlmann و Eva Engvall نهايتا به روش ELISA به شيوه امروزي دست پيدا كردند. ELISA امروزي مزاياي زيادي نسبت به روشهاي ايمني سنجي راديويي دارند. از جمله عدم وجود خطر تشعشع، امكان اتوماسيون، امكان افزايش حساسيت روش، عمر طولاني كيت هاي آنزيمي، سرعت خوانش بالا و قيمت ارزانتر دستگاهها و معرف ها.
تست ELISA با روشهاي
گوناگوني انجام ميشود كه كه به صورت كلي به دو دسته ELISA
مستقيم و غير مستقيم تقسيم بندي ميشود. در روش
مستقيم آنتي ژن يا آنتيبادي مورد نظر به طور مستقيم بر سطح فاز جامد پوشش داده مي
شود و سپس آنتيبادي يا آنتي ژن مكمل نشاندار شده آن به سيستم اضافه ميشود. با آناليز
سيگنال توليد شده ميتوان پي به وجود آنتي ژن يا آنتي بادي مورد نظر در نمونه برد.
اين روش ارزش تشخيصي چنداني نداشته و بيشتر كاربرد تحقيقاتي دارد.
در روش غير مستقيم سرم رقيق شده به آنتي ژن هاي
پوشش داده شده در فاز جامد اضافه مي شود، سپس نمونه را به آن اضافه كرده و پس از
گذشت زمان انكوباسيون و يك مرحله شستشو، آنتي هيومن گلوبولين نشاندار شده با آنزيم
به چاهك اضافه مي شود. اين روش براي تعيين آنتي بادي اختصاصي يا تيتراسيون آنتي
بادي در سرم استفاده ميشود.
روش هاي ELISA ساندويچ
و ELISA رقابتي يا مهاري از ديگر انواع متداول اين تكنيك
هستند. روش ساندويچ كه متداولترين روش ELISA است، يك
آنتي ژن در بين دو آنتي بادي اختصاصي قرار مي گيرد. روش هاي رقابتي نيز بر پايه
رقابت دو آنتي ژن يا دو آنتي بادي براي اتصال ليگاند با مقدار محدود استوار است.
اگر اضافه كردن هردو آناليت به سيستم همزمان انجام شود، روش را رقابتي مي نامند
ولي چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يك دوره زماني انكوباسيون آناليت
نشاندار اضافه گردد روش را مهاري مي نامند.
مراحل انجام يك آزمون ELISA كه
تقريبا در تمام انواع آن مشترك است عبارت است از:
1) پوشش دهي، كه به معني جذب يك آنتيژن يا آنتيبادي
با سطوح جامد است.
2) اضافه كردن نمونههاي مورد آزمايش
.
3) گذشت مدت زمان كافي براي انجام واكنش كه به
اصطلاح انكوباسيون واكنشگرها ناميده مي شود.
4) انجام عمل شستشو توسط واشر ELISA ، به منظورجدا كردن
واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده .
5) اضافه عوامل لينك شده با آنزيم.
6) مجددا طي مدت زمان انكوباسيون براي واكنشگرها .
7)استفاده مجدد از واشر ELISA جهت
انجام عمل شستشو .
8) افزودن زيرلايه آنزيم جهت تشخيص واكنش دهندهها.
9) طي زمان انكوباسيون.
10) اتمام واكنش آنزيمي توسط متوقف كنندهها و خوانش
دانسيته نوري به دست آمده توسط خواننده .ELISA
براي انجام تست ELISA بايد
نمونه خون از بيمار گرفته شود و سرم آن جدا شود. براي اين
كار بايد به مواردي دقت داشت. مثلا از بستن گارو براي مدتي طولاني بايد اجتناب كرد
چرا كه ممكن است در پارامترهاي مورد اندازه گيري تاثير گذاشته و موجب بروز خطا
شود. در هنگام جداسازي سرم نيز بايد دقت شود كه فيبرينوژن يا ذرات ديگر نباشد. پيش
از انجام آزمايش بايد به كيفيت كيت هاي مورد مصرف توجه كرد، همچنين نگهداري آنها
بايد در دمايC 8-2 صورت
گيرد. تمامي محلولهاي موجود در كيت قبل از مصرف
بايدخوب مخلوط شده و به دماي آزمايشگاه برسد و پس از استفاده به منظور
افزايش پايداري، بلافاصله اجزاء كيت به يخچال منتقل شود. درحين انجام آزمايش بايد
از نوسانات غير تدريجي دما در هنگام انكوباسيون، مانند باز بودن پنجره يا درب
آزمايشگاه در محل آزمايش جلوگيري كرد. ايجاد پديده هوك باعث ايجاد نتايج پايين
كاذب ميشود لذا توصيه ميشود براي جلوگيري از اين پديده سرم رقيق نشده و سرم يك
دهم رقيق شده، مخلوط وآزمايش را انجام دهيم، تا اثر احتمالي هوك اصلاح شود. از آنجا
كه فريز و ديفريز كردن نمونه ها باعث كاهش سطح برخي از هورمون ها ميشود، بايد تا
حد ممكن از اين كار پرهيز شود. پيش از اندازه گيري بايد كليه ابزارهاي مورد
استفاده اعم از نوك ابزار نمونهگيري و كيت ها استريل شوند. كه البته استفاده از ابزارهاي
يكبار مصرف پيشنهاد ميشود و بايد قبل از استفاده لوله آزمايش هاي شيشهاي آنها
را با اسيد سولفوريك رقيق شستشو داده و با آب مقطري كه دوبار تقطير شده آبكشي
انجام داد. از به كار بردن محلولهاي شستشوي نامناسب يا آب مقطر ناخالص بايد
پرهيز كرد. ضمنا بايد از كاركرد صحيح دستگاهها و تجهيزات مورد استفاده به عنوان
مثال از صحت طول موج فيلترهاي خواننده ELISA به كمك
استفاده از ماده رنگي با ثبات، نظير بيكرومات پتاسيم يا عملكردصحيح دستگاه واشر ELISA اطمينان
حاصل كرد.
شيكر ELISA SHAKER) ELISA)
تكان دادن ميكروپليت ها )shaking( از مهمترين
بخش هاي تكنيك ELISA است، چرا كه تاثير زيادي در تغيير رنگ محيط
آنزيمي پس از افزودن محلول اسيدي دارد. استفاده
از روتاتور معمولي با قطر چرخش زياد و تعداد دور كم و در نتيجه تكان دادن آهسته
ميكروپليتها باعث خوب مخلوط نشدن معرفها و در نتيجه ادامه و پيشرفت جزئي واكنش
در طي زمان و به روز خطا ميشود. همچنين تكان شديد اين پليت ها نيز باعث آلوده شدن
چاهك هاي ميكرو پليت با هم ميشود. شيكر ELISA دستگاهي
است كه براي مخلوط كردن محتويات ميكروپليتها به كار گرفته مي شود. شيكر ELISA با حركت
سريع با قطر چرخش كم باعث اختلاط مناسب معرفها و در نتيجه پيشرفت واكنش در طي
زمان ميشود. شيكرهاي امروزي مجهز به سيستم كنترل زمان و كنترل دور به صورت
ديجيتال است.
واشر ELISA washer)ELISA)
از ديگر مراحل مهم تست ELISA ، شستشو است كه در هر مرحله
از تست به منظور دفع و تخليه كامل مولكولهاي غير اختصاصي از محيط واكنش انجام مي
گيرد. شستشو به دو صورت دستي و خودكار انجام مي شود. ابتدايي ترين روش شستشو،
شستشوي دستي است بدين ترتيب كه مايع شستشو را با پيپت بر روي چاهك ها ريخته و سپس آن
را در سينك خالي مي كنند. فشار بالاي شستشو در روش دستي كه به علت تخليه سريع بافر
به وجود ميآيد، منجر به جداشدن و حذف اتصالات اختصاصي از كف چاهكها و كاهش كاذب
ميشود، همچنين فشار پائينشستشو ناشي از تخليه آهسته بافر، باعث عدم دفع كامل
اتصالات غير اختصاصي و افزايش كاذب جذب نوري ميشود. بهتر است در روش دستي تا
نزديك لبه فوقاني چاهك ها از محلول شستشو پر شود، در صورت پر شدن لب به لب چاهكها،
احتمال آلودگي چاهك به چاهك افزايش پيدا ميكند. همچنين بايد از سرريز شدن
محلول شستشو، ايجاد حباب هوا در چاهكها و تماس با كف چاهك جلوگيري كرد. در هنگام
تخليه چاهكها نيز بايد مكش و تخليه به طور كامل انجام شده و دقت شود كه حتي ذره
اي از مايع بافر در كف چاهكها باقي نماند. اما اين روش شستشو (شستشوي دستي) بسيار
وقت گير بوده و خطر آلودگي محيط و كاربر را در پي دارد. از اين رو دستگاههاي خودكار
واشر ELISA براي شستشوي پليت ها به وجود آمده است كه علاوه
بر دقت و ايمني بالاتر، سريعتر و راحتتر عمل شستشو را انجام مي دهند. اين دستگاهها
در انواع مختلف 8 يا 12 كاناله، تك سوزنه و دوسوزنه موجود است. در انواع
دو سوزنه، يك سوزن براي ريختن و ديگري براي خالي كردن محلول شستشو استفاده ميشود
بدين ترتيب كه يك سوزن به طور دائم در حال مكش است تا اگر مايع شوينده بيشتري در
هنگام پر كردن وارد چاهك ها شد ، آنرا خالي كند و اين در حالياست كه در
مدل تك سوزنه تمامي اقدامات توسط همان يك سوزن صورت مي گيرد.
(ELISA reader) ELISA)
ELISA در واقع يك دستگاه فتومتر است كه در آخرين بخش از تست ELISA به طور اختصاصي براي خواندن نمونه هاي مربوطه طراحي شده است. وظيفه آن طيفسنجي نوري يا خوانش دانسيته نوري واكنش ELISA است. طول موج مشخصي از نور از پائين درون چاهك ميگذرد، در مسير آن فيلتر مناسبي باتوجه به نوع آنزيم و نوع سوبستراي آنزيم جهت دستيابي به طول موج مطلوب قرار داده مي شود. در بسياري از خوانشگرها سيستم تك موج يا دو موج است و جهت برطرف سازي نقص سيستم نوري ، تغييرات چاهك به چاهك حجم نهايي در چاهك ها، تصحيح جذب نوري به طور خودكار صورت مي گيرد . اين عمل توسط نوع خاصي از فيلترتحت عنوان فيلترهاي تفاضلي صورت مي گيرد. خوانش ميزان جذب محتوي چاهكها توسط خواننده ELISA الزاما بايستي در زمان تعيين شده انجام شود. بعضي از دستگاههاي خواننده ELISA قابليت برنامهريزي زماني، نوع تشخيص و كنترل و در نهايت مشخص كردن مثبت يا منفي بودن نمونههاي مجهول را دارا هستند.
امروزه انواع مختلفي از خوانشگرها براي پليت ها ي ELISA در بازار
موجود هستند اكثر اين خوانشگرها يك ستوني يا 96 خانه (يك پليتي) بوده كه
اكثرا خودكار و تعداد اندكي نيز دستي هستند. اين دستگاهها داراي فيبرهاي نوري
هستند. در دستگاههاي خواننده انتخاب طول موج توسط فيلترها يا گريدها (گريتينك
ساختارهايي كه با تابيده شدن نور به آنها، تنها نور با طول موج خاصي ازآنها ساطع
مي شود) انجام مي شود. براي چاپ نتايج نمونههاي موردآزمايش
، يا دستگاه خود داراي پرينتر است يا مي توان آنرا به پرينتري متصل كرد. همچنين
مي توان جهت انجام محاسبات بيشتر خواننده ELISA را به
كامپيوتر وصل كرد
سيستم الايزا بر اساس شيوه شناسي تشخيصي به چند گروه تقسيم مي شود كه عبارتند از:
1)الايزاي مستقيم(DIRECT ELISA):
الايزاي مستقيم براساس جذب يا پوششدهي آنتيژن
· مرحلة اول: پوششدهي آنتيژن بر روي پليتها
· مرحلة دوم: شستشو
· مرحلة سوم: افزودن كونژوگه (آنتيبادي اتصال يافته با آنزيم) و گذراندن زمان انكوباسيون
· مرحلة چهارم: شستشو
· مرحلة پنجم: افزودن سيستم رنگي
· مرحلة ششم: قرائت پليت با الايزاريدر
توضيح: در اين نوع الايزا، آنتيژني كه به ته پليت متصل ميشود مستقيما با كونژوگه وارد واكنش ميشود. اين نوع روش الايزا، فقط در موارد مشخص استفاده مي شود و آن موردي است كه مي خواهيم بدانيم كه كونژوگه ما براي انجام واكنش مناسب هست يا خير. يعني در اينجا آنتي ژن معمولا IgG ميباشد. بنابراين راه اصلي سنجش واكنش يا عدم واكنش كونژوگهاي كه عليه يك آنتيبادي تهيه شده است ، اين روش ميباشد.
تيتر كونژوگه را نيز ميتوان با استفاده از اين روش الايزا سنجيد. امروزه براي سنجيدن واكنش مونوكلونال آنتيبادي كونژوگه شده با يك آنزيم كه برعليه يك آنتيژن خاص ميباشد از اين روش استفاده ميكنند.
در اين روش آنتي ژن يا آنتي بادي موجود در نمونه ي كه بايد تشخيص داده شود به طور مستقيم بر سطح فاز جامد كوت مي شود و سپس آنتي بادي يا آنتي ژن مكمل آن كه نشان دار شده است به سيستم اضافه ميشود. در صورت وجود آنتي ژن يا آنتي بادي مورد نظر در نمونه ي سيگنال مناسب ايجاد مي شود. اين روش مشابه ايمونوفلورسانس مستقيم است اما كاربرد چنداني در كيت هاي تشخيصي ندارد و بيشتر در كارهاي تحقيقاتي استفاده مي شود
2)الايزاي غير مستقيم(INDIRESITI ELISA):
· مرحلة اول: پوششدهي آنتيژن
· مرحلة دوم: شستشو
· مرحلة سوم: افزودن آنتيبادي (عليه آنتيژن پوشش داده شده) و گذراندن زمان انكوباسيون
· مرحلة چهارم: شستشو
· مرحلة پنجم: افزودن كونژوگه (آنتيبادي ثانوية همراه با آنزيم عليه آنتيبادي اوليه) و گذراندن زمان انكوباسيون
· مرحلة ششم: شستشو
· مرحلة هفتم: افزودن سيستم رنگي
· مرحلة هشتم: قرائت پليت با الايزاريدر
توضيج: اين روش بسيار رايج ميباشد و معمولا براي مشخص نمودن آنتيبادي عليه يك پاتوژن خاص يا عليه يك مادة خاص درون سرم از اين روش استفاده ميشود.ویژگی اندازهگيري بستگي به خلوص آنتيژني متصل شده به پليت دارد. در اين روش سرم ما ميتواند حاوي آنتيبادي عليه آنتيژن باشد (مثلا در افراد مبتلا به بيماري كه بدنشان عليه پروتئينهاي آنتی ژنی يک پاتوژن آنتيبادي ساخته است) و ميتواند آنتيبادي عليه آن آنتيژن نداشته باشد (افراد سالم). در اين روش در مراحل اوليه و تنظيم تست الايزا، ميتوان سرم را با رقتهاي مختلف اضافه كرد (سرم را ميتوانيم با محلول رقيق كنندة سرم رقيق كنيم) و بهترين رقت را در تستهاي الايزاي موازي كه فقط رقت سرم آنها متفاوت است بدست آورد. اين روش در كيتهاي تجاري تشخيص بيماريها بوفور استفاده ميشود. با استفاده از اين روش تيتراسيون كونژوگه نيز انجام ميشود.
اين روش براي تعيين آنتي بادي اختصاصي و يا تيتراسيون آنتي بادي در نمونه هاي سرم مورد استفاده قرار مي گيرد. اساس آزمايش بدين نحو است كه معمولا سرم رقيق شده به آنتي ژن هاي كوت شده در فاز جامد (ميكرو ول يا چاهك) اضافه مي شود. آنتي ژن كوت شده آنتي ژت اختصاصي مربوط به آنتي بادي است كه قرار است در نمونه رديابي شود پس از افزودن نمونه و طي زمان انكوباسيون و يك مرحله ي شستشو آنتي هيومن گلوبولين نشان دار شده با آنزيم به چاهك اضافه مي شود بر حسب اينكه چه كلاسي از انتي بادي براي رديابي اهميت دارد نوع آنتي Ig مورد استفاده نيز متفاوت است مثلا براي رديابي آنتي بادي كلاس IgG از انتي هيومن IgG و براي رديابي كلاس IgA از آنتي هيومن IgA استفاده مي شود.
سرم حاوي انتي بادي اختصاصي مي تواند در يك بافر براي جلوگيري از جذب غير اختصاصي پروتئين ها و جلوگيري از اشغال نقاط اتصال آنتي ژن رقيق شود. به چنين بافري محلول رقيق كننده نمونه (sample diluent) گفته مي شود. حساسيت و ويژگي چنين روشهايي مي تواند با به كار گيري روش Antibody capture با كاهش تداخل اثر آنتي بادي غير اختصاصي بهتر شود.
بهترين مثالها در مورد اين روش تعيين آنتي بادي بر عليه توكسوپلاسما,روبلا ,ويروس سيتومگال و هليكوباكترپيلوري از كلاسهاي IgMو igAوigG در سرم مي باشد.البته امروزه براي تعيين IgM بر عليه اين عوامل عموما از روش capture استفاده مي شود در روش capture آنتي بادي هاي موجود در نمونه از كلاسIgM به روي چاهك هاي كد شده با آنتي هيومن IgM جذب شده و سپس براي تشخيص , از آنتي ژن اختصاصي مربوطه كه آنزيم نشان دار شده اسنت و يا آنتي بادي نشان دار ضد آن به صورت مزدوج استفاده مي شود.
الايزاي ساندويچ:
روش ساندويچ الايزا خود به 2 دسته تقسيم مي شود:
الف)روشAg capture يا Ab sandwich
در اين روش يك آنتي ژن در بين 2آنتي بادي اختصاصي قرار مي گيرد اين روش شايع ترين روش الايزا محسوب مي شود در اين روش از يك آنتي بادي براي به دام انداختن آنتي ژن بر روي چاهكهاي الايزا استفاده مي شود و آنتي بادي دوم كه با آنزيم نشان دار شده است به عنوان شناساگر عمل مي كند .
قابل ذكر است كه در اين روش آنتي ژن بايد حداقل دلراي 2 ناحيه ي آنتي ژنيك متفاوت باشد تا قادر به اتصال هر 2 آنتي بادي باشد مثال هاي بارز اين روش اندازه گيري PSA ,FSH ,LH ,TSH ,HCG و....... است.
ب) روش Antibody capture
1-Ag sandwich or direct Ab capture
ساندويچ مستقيم
· مرحلة اول: پوششدهي آنتيبادي
· مرحلة دوم: شستشو
· مرحلة سوم: افزودن آنتيژن و گذراندن زمان انكوباسيون
· مرحلة چهارم: شستشو
· مرحلة پنجم: افزودن آنتيبادي كونژوگه شده با آنزيم و گذراندن زمان انكوباسيون
· مرحلة ششم: افزودن سيستم رنگي
· مرحلة هفتم: قرائت پليت توسط الايزاريدر
توضيح: دو آنتيبادي كه در اين سيستم بكار ميروند ميتوانند هر دو از يك گونه باشند و يا ميتوانند از گونههاي متفاوتي از موجودات بدست آيند. گاهي اوقات به آنتيژني كه در اين سيستم بكار ميرود آنتيژن تسخير شده يا به دام افتاده ميگويند. در اين روش استفاده از محلولهاي بلوكه كننده يا افزودن محلولهاي بلوكه كننده به محلول پوششدهي و محلولهاي شستشو بسيار مهم است.
نكتة مهم در اين روش آنست كه بايد بدانيم كه آنتيژن ما حداقل دو محل اتصال به آنتيبادي داشته باشد تا بتواند به اين آنتيباديها متصل شود.
اين روش براي تعيين سنجش آنتي بادي مورد استفاده قرار مي گيرد بدين صورت كه از يك آنتي ژن كوت شده بر روي فاز جتمد براي به دام انداختن آنتي بادي اختصاصي آن استفاده مي شود و همان آنتي بادي از طريق بازوي ديگر خود (Fab) پذيراي همان آنتي ژن اما به صورت نشان دار مي باشد در نتيجه آنتي بادي اختصاصي در بين 2 آنتي ژن ساندويچ مي گردد(شكل 22-2) در اين روش آنتي بادي توتال از هر كلاس ايمونوگلوبولين ميسر است و يكي از اختصاصي ترين و حساس ترين روش ها براي تشخيص آنتي بادي در نمونه است مثال بارز اين روش كيت اندازه گيري آنتي بادي بر عليه پلاسموديوم و يواكس و ترپونماپاليدوم HBs Ab مي باشد.
2-Indirect Ag Sandwich or Indirect Ab capture
ساندويچ غير مستقيم
· مرحلة اول: پوششدهي آنتيبادي
· مرحلة دوم: شستشو
· مرحلة سوم: افزودن آنتيژن و گذراندن زمان انكوباسيون
· مرحلة چهارم: شستشو
· مرحلة پنجم: افزودن آنتيبادي عليه آنتيژن
· مرحلة ششم: شستشو
· مرحلة هفتم: افزودن آنتيبادي سوم كونژوگه شده با آنزيم (عليه آنتيبادي دوم)
· مرحلة هشتم: شستشو
· مرحلة نهم: قرائت پليت توسط الايزاريدر
در اين روش پس از به دام انداختن آنتي بادي توسط آنتي هيومن گلوبولين ك.ت شده در كف چاهك ها با اضافه كردن آنتي ژن اختصاصي و تشكيل كمپلكس از يك آنتي بادي اختصاصي نشان دار بر عليه آنتي ژن به عنوان سيستم شناساگر استفاده مي شود.
مشخص است كه آنتيبادي دوم بايد از يك گونة متفاوت از موجودات تهيه شود.
الايزاي رقابتي يا مهاري
در روشهاي رقابتي اساس سنجش بر رقابت دو آنتي ژن يا دو آنتي بادي ( كه يكي از آن دو نشاندار است) براي اتصال به ليگاند با مقدار محدود استوار است. اگر هر دو آناليت نشاندار و غير نشاندار با هم به سيستم اضافه شوند روش را رقابتي مي نامند ولي چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يك دوره انكوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاري يا بالكينگ مي نامند. در روش مهاري ممكن است در بين 2 مرحله و قبل از اضافه نمودن آناليت بعدي شستشو انجام شود يا انجام نشود مثال بارز روشهاي رقابتي و مهارتي سنجش T3,T4 مي باشد. انواع روشهاي رقابتي عبارتند از:
الف) روش رقابتي يا مهاري براي انتي ژن:
اساس اين روش بر رقابت بين آنتي ژن نشاندار و آنتي ژن موجود در نمونه براي اتصال به يك آنتي بادي اختصاصي كوت شده در چاهك استوار است. در اين روش مقدار آنتي بادي كوت شده بايد محدود باشد و ملكول سيگنال دهنده همان آنتي ژن نشاندار است, اساس RIA و EIA كلاسيك به همين روش استوار است(شكل 24-2)
در اين روش منحني پاسخ- دوز به صورت معكوس خواهد بود, بدين معني كه آناليت نشاندار در حضور مقادير زيادي از آناليت غير نشاتندار موجود در نمونه به مقدار كمتري به آنتي بادي متصل مي شود و در نتيجه سيگنال هم بوجود خوههد آمد.
محدوده تعيين آناليت با اين روش ممكن است بوسيله استفاده از مولكول نشاندار با فعاليت اختصاصي زياد تقويت شود اما حداقل مقدار قابل تشخيص (كمترين مقدار از آناليت كه قابل تشخيص خواهد بود) توسط تمايل ؟آنتي بادي مورد استفاده تعيين مي شود, با اين وجود غلظتهاي خيلي كم از هاپتن ها عموما توسط همين روش قابل تعيين اند و حساس ترين روشي است كه مي تواند مقدار كمتر fmol را هم تشخيص دهد.
در برخي از موارد نشاندار كردن روي خصوصيات هاپتن اثر مي گذارد در نتيجه در روش رقابتي براي تعيين آنتي ژن از يك آنتي بادي نشاندار استفاد مي شود, در اين نوع از سنجش ها اين مطلب ضروري است كه فاز جامد توسط آنتي ژن با مقدار كم و ثابت پوشيده مي شود, در اين روش آناليت موجود در نمونه با آناليت كوت شده در چاهك براي اتصال به آنتي بادي نشاندار رقابت مي كند. در اينجا هم منحني استاندار معكوش است, از اين روش بيشتر براي سنجش به روش كمي لومينسانس استفاده مي شود.
ب)روش رقابتي براي آنتي بادي:
دراين روش بين دو آنتي بادي يكي در نمونه به صورت غير نشاندار و يكي به صورت نشاندار شده با آنزيم برا اتصال به يكي آنتي ژن ك.ت شده در چاهك صورت مي پذيرد, بديهي است كه هر چه مقدار آنتي بادي نمونه بيشتر باشد انتب بادي نشاندار كمتري به چاهكها متصل شده و سيگنال نيز كمتر خواهد بود و در نتيجه منحني استاندار نيز معكوس مي باشد و در نتيجه منحني استاندار نيز معكوش مي باشد, شاخص ترين مثال اين روش اندازه گيري آنتب باد بر ضد HBc (HBc Ab) است.
باسلام من ازبروبچه های گروه زیست هستم واز علاقمندان رشته زیست شناسی هستم که این وبلاگ تقدیم میکنم به